Современные методы диагностики мужского бесплодия в лаборатории ВРТ

Врач клинической лабораторной диагностики, эмбриологическое отделение, Next Generation Clinic, Кухтина Ю.А., 2023.

По определению ВОЗ, бесплодие – это отсутствие беременности у женщины при регулярной половой жизни в паре, без применения контрацепции в течение 1 года и более. Проблема бесплодия затрагивает более 15% супружеских пар, около 50% причин бесплодия приходится на долю мужского фактора. Мужское бесплодие — это нарушение мужской репродуктивной функции, которое выражается в количественном или качественном изменении сперматозоидов (ВОЗ, 2021).

Фертильность мужчин может снижаться в результате следующих факторов:

• врожденные или приобретенные аномалии мочеполовых органов;
• онкологические заболевания;
• инфекции мочеполовой системы;
• эндокринные нарушения;
• генетические отклонения;
• варикоцеле;
• аутоиммунные заболевания;
• половая дисфункция;
• продолжительное воздействие на организм токсичных веществ – алкоголя, никотина, наркотиков;
• воздействие на организм в прошлом или в настоящем радиации, в том числе и в лечебных целях;
• вредные условия окружающей среды, в том числе производственные факторы;
• возраст;
• системные заболевания.

В значительном количестве случаев причины мужского бесплодия не выявить (идиопатическое бесплодие).

Для диагностики и выявления причин мужского бесплодия применяется большое количество различных методов: физикальное обследование, инструментальная и лабораторная диагностика.           Одним из базовых методов лабораторной диагностики мужского бесплодия является спермограмма, однако её результаты не могут в полной мере характеризовать способность мужчины зачать ребенка. В большинстве случаев бесплодие, связанное с мужским фактором, проявляется отклонениями в параметрах спермограммы.

Эякулят имеет два основных количественных параметра:

• число сперматозоидов характеризует выработку спермы яичками, проходимость посттестикулярной системы протоков, эффективность сокращений гладких мышц придатка яичка и семявыносящих протоков для активного переноса сперматозоидов в уретру, а также эффективность эрекции и эякуляции для выброса эякулята, богатого сперматозоидами;
• объем жидкости, вырабатываемой различными добавочными железами, характеризует секреторную активность желез и последующие сокращения гладкой мускулатуры, способствующие опорожнению каждой железы.

Качество сперматозоидов (их жизнеспособность, подвижность и морфология) и состав жидкостей эякулята также важны для функционирования сперматозоидов.

Результаты лабораторных измерений параметров эякулята зависят от следующих факторов:

• обеспечение сбора всего эякулята полностью;
• деятельность добавочных половых желез, жидкость которых разбавляет концентрированные эпидидимальные сперматозоиды при эякуляции;
• время между сбором исследуемого эякулята и предыдущей эякуляцией;
• факторы, связанные с пациентом, которые оказывают воздействие на эякулят (размер яичек, эндокринный статус, прием лекарственных препаратов и др.)

Есть данные, что результатов исследования одного единственного эякулята достаточно для принятия решения о последующих этапах обследования мужчины на предмет бесплодия. С другой стороны, для определения точных базовых данных для конкретного мужчины может потребоваться исследование двух или трех эякулятов.

В анализе эякулята может наблюдаться снижение числа сперматозоидов (олигозооспермия), подвижности (астенозооспермия), ухудшение морфологии сперматозоидов (тератозооспермия). Часто эти изменения могут наблюдаться совместно и обозначаются как олигоастенотератозооспермия.       При высоком количестве неподвижных сперматозоидов в эякуляте важно оценить жизнеспособность сперматозоидов.

Жизнеспособность сперматозоидов, оцениваемая по целостности клеточной мембраны, может определяться в обычном порядке во всех образцах эякулята, но в случае, когда по меньшей мере 40% сперматозоидов подвижны, это не требуется. В образцах, содержащих сперматозоиды с плохой подвижностью, тест на жизнеспособность имеет важное значение для различения неподвижных мертвых сперматозоидов от неподвижных живых сперматозоидов (VitalScreen, FertiPro). Наличие большого количества живых, но неподвижных клеток может свидетельствовать о структурных дефектах жгутика; высокий процент неподвижных мертвых клеток может указывать на патологию придатка яичка или иммунологическую реакцию вследствие инфекции.

Процентная доля живых сперматозоидов оценивается путем выявления сперматозоидов с неповрежденной клеточной мембраной методом исключения красителя (мертвые клетки имеют поврежденную цитоплазматическую мембрану, которая позволяет проникать красителям, не способным к проникновению через мембрану) или путем проведения теста на гипотоническое набухание. Рекомендуемым тестом для диагностики является эозин-нигрозиновый тест (ВОЗ, 2021)      При оценке образца эякулята важно так же обращать внимание на концентрацию клеток отличных от сперматозоидов, так называемых «круглых клеток», в число которых входят клетки сперматогенеза и лейкоциты.

В норме по рекомендациям ВОЗ (2021) концентрация лейкоцитов в эякуляте не должна превышать 1млн/мл. Причинами повышенного количества лейкоцитов в эякуляте (лейкоспермии) могут быть:

• наличие инфекций, передаваемых половым путем (ИППП);
• воспаление предстательной железы(простатит);
• воспаление мочеиспускательного канала (уретрит);
• воспалительные процессы в ткани яичка;
• воспаление в семенных пузырьках и семявыносящих канальцах; — а также ряд других соматических заболеваний.

Дифференцировать лейкоциты от других «круглых клеток» можно в мазке, окрашенном по Папаниколау или в качестве экспресс-метода, использовать реактивы для определения пероксидаза-положительных клеток (LeucoScreen Plus FertiPro). Данный метод позволяет обнаружить в эякуляте клетки крови, которые содержат гранулы с пероксидазой (гранулоциты), но не обнаруживают клетки, которые этих гранул не содержат (лимфоциты, моноциты). Так как наибольшее количество лейкоцитов в эякуляте представлено гранулоцитами, информативность данного метода достаточно высокая.

Значительное снижение подвижности сперматозоидов (астенозооспермия) и наличие агглютинации сперматозоидов (т.е. подвижные сперматозоиды прилипают друг к другу головка к головке, хвост к хвосту или смешанным образом) может быть следствием присутствия антиспермальных антител в эякуляте (SpermMar Test IgG FertiPro).

Антиспермальные антитела могут присутствовать без агглютинации сперматозоидов; в равной мере агглютинация может быть вызвана другими факторами, отличными от антиспермальных антител.        АСАТ, обнаруживаемые в семенной жидкости, принадлежат почти исключительно к двум классам иммуноглобулинов: IgA и IgG. Антитела класса IgM из-за их более крупного размера и основной функции на острой стадии инфекции редко обнаруживаются в эякуляте. Антитела IgA могут иметь более важное клиническое значение, чем антитела IgG, но более чем 95% образцов, содержащих антиспермальные антитела IgA, положительны также на IgG. Оба класса могут быть обнаружены на сперматозоидах или в биологических жидкостях с помощью соответствующих скрининговых тестов.

Одним из важных исследований для определения причин мужского бесплодия на сегодняшний день является оценка оксидативного стресса или измерение количества свободных радикалов в эякуляте (АФК/ROS тест). Свободные радикалы — это специфические продукты жизнедеятельности клеток, вещества, которые образуются в результате различных химических реакций – распада вредных жиров, обмена веществ (или нарушения обмена) и воспалительных процессов. В эякуляте человека АФК продуцируются сперматозоидами, незрелыми клетками сперматогенеза и лейкоцитами. Один лейкоцит может генерировать по меньшей мере в 100 раз больше АФК, чем сперматозоид.

Избыточное количество АФК в эякуляте может приводить к повреждению липидов и белков клеточной мембраны сперматозоида и структуры молекулы ДНК. В свою очередь повреждение молекулы ДНК (фрагментация ДНК сперматозоидов) может быть причиной остановки развития эмбрионов, нарушения имплантации эмбрионов и замерших беременностей, как при естественном зачатии, так и при искусственном оплодотворении.

Компенсировать влияние оксидативного стресса возможно с помощью приема антиоксидантных препаратов, но по данным современных исследований, назначение антиоксидантов следует проводить только под контролем уровня АФК.

Определение фрагментации ДНК сперматозоидов на данный момент вызывает много споров, но несмотря на это данный тест вошел в список расширенных исследований эякулята в шестое издание «Лабораторного руководства ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека».

Фрагментация ДНК сперматозоидов, лишь отчасти связана с качеством сперматозоидов и может стать важным дополнительным компонентом в клиническом исследовании мужского бесплодия. Для оценки фрагментации ДНК сперматозоидов на данный момент применяются следующие разновидности лабораторных тестов:

• TUNEL-тест (введение концевой метки с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TDT))
• Comet-тест (анализ единичной клетки методом гель-электрофореза) непосредственно оценивают наличие однонитевых и/или двунитевых разрывов в ДНК;
• цитометрия с акридиновым оранжевым (AO FCM);
• тест дисперсии хроматина сперматозоидов (SCD) определяет восприимчивость хроматина к обработке кислотой.

Наиболее доступным методом исследования фрагментации ДНК сперматозоидов на сегодняшний день является исследование дисперсии хроматина сперматозоидов (SCD-тест). Это связано с доступностью коммерческих наборов для данного анализа, и отсутствием необходимости использования сложного лабораторного оборудования. Оценка результата исследования проводится с помощью световой микроскопии.

SCD-тест основан на том, что после денатурации и экстракции ядерных белков целые петли ДНК расширяются, тогда как при фрагментации ДНК дисперсия не развивается или является минимальной. Неповрежденный хроматин сперматозоидов образовывает ореолы рассеяния после воздействия кислоты и лизирующего раствора; ореолы соответствуют расслабленным петлям ДНК, прикрепленным к остаточной ядерной структуре, которые высвобождаются после экстракции ядерных белков.

Разрывы ДНК, поскольку они подвержены денатурации, препятствуют такой дисперсии.             Уровень фрагментации ДНК сперматозоидов может коррелировать с выраженностью оксидативного стресса, но эти тесты не заменяют, а дополняют друг друга, помогая более точно выявить причину мужского бесплодия и подобрать правильные методы лечения.

Наряду с оценкой качества сперматозоидов следует обратить внимание и на биохимические анализы функции добавочных половых желез.

Для оценки функции добавочных желез можно измерять концентрацию их секретов. Концентрация лимонной кислоты, цинка, глутамилтранспептидазы и кислой фосфатазы отражают работу предстательной железы. Концентрация фруктозы в семенной жидкости является показателем секреторной функции семенных пузырьков. Маркерами функции придатка яичка, используемыми в клинической практике, являются уровни L-карнитина, ГФХ и нейтральной α-гликозидазы. Назначение биологически активных препаратов для повышения мужской фертильности рекомендуется проводить под контролем данных показателей.

Ни один из представленных методов лабораторной диагностики не может в одиночку дать ответ на вопрос «фертилен мужчина или нет». На данный момент спермограмма является базовым стандартным исследованием, но нормальные показатели спермограммы не гарантируют фертильность мужчины, также как и патологические показатели не свидетельствуют о невозможности зачатия. Для постановки точного диагноза, определения причин мужского бесплодия и назначения правильного лечения необходимо использовать все имеющиеся методы диагностики.

Литература:

• World Health Organization. (2010). WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, 5th ed. World Health Organization.
• World Health Organization. (2021). WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, 6th ed. World Health Organization.
• Сохранение фертильности мужчин: учеб. Пособие для врачей. / под ред. О. Б. Жукова; Федеральное гос. авт. Образовательное учреждение высш. Образования «Российский гос.ун-т дружбы народов».- Москва: СИМК, 2017. – 184с.
• Клинические рекомендации по андрологической урологии. / под ред. П.А. Щеплева. – М. Медфорум, 2016. – 120с.
• Клинические рекомендации – Мужское бесплодие – 2021 (21.05.2021) – Утв. Минздравом РФ. – 25с.
• Руководство по клинической эмбриологии. /под ред. В.С. Корсак – М.: СИМК, 2019. – 224с. — Божедомов В.Д., Машина М.А., Шарапова Е.И., Камалов А.А. Репродуктивная андрология сегодня: что следует знать гинекологам-репродуктологам? Кремлевская медицина. Клинический вестник. 2020; 3; 129-137. — Корнеев И.А., Зассеев Р.Д., Исакова Э.В. и др. Оказание медицинской помощи с применением вспомогательных репродуктивных технологий у мужчин: обзор клинических рекомендаций и алгоритм маршрутизации пациентов. Проблемы репродукции. 2018; 24(4): 59-65.