Оксидативный стресс в эякуляте: связь с фрагментацией ДНК и наличием округлых клеток

Оксидативный стресс играет важную роль в этиологии мужского бесплодия, влияя на качество спермы, ее функции, а также связан с фрагментацией ДНК сперматозоидов. Оценка окислительного стресса в сперме может быть важным инструментом для улучшения оценки репродуктивной способности сперматозоидов. Цель данного исследования — оценка любой возможной связи между дисбалансом окислительного стресса, вызванным супероксид-анионом в эякуляте, с наличием фрагментации ДНК сперматозоидов и высокой концентрацией круглых клеток. 56 образцов спермы мужчин из пар, страдающих бесплодием, были оценены в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 2010 года. Уровни оксидативного стресса от N1 (низкий) до N4 (высокий) были оценены в эякулятах с помощью коммерческого набора ОxiSperm; индекс фрагментации ДНК сперматозоидов, оцененный с помощью SCSA (анализ структуры хроматина сперматозоидов), использовался для оценки целостности хроматина сперматозоидов. Наши данные показывают, что высокий окислительный стресс (уровни N3-N4) положительно коррелирует с DFI≥30% (=0,0379) и круглые клетки ≥1500000/мл (=0,0084). В заключение, оксидативный стресс сперматозоидов увеличивает повреждение ДНК сперматозоидов. Таким образом, оценка степени повреждения ДНК сперматозоидов в сперме у бесплодных мужчин может быть полезна для разработки новых терапевтических стратегий и повышения эффективности вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

Введение

Одной из причин мужского бесплодия и повреждения ДНК сперматозоидов является наличие несбалансированных активных форм кислорода. Оксидативный стресс сперматозоидов (ОС) возникает, когда выработка активных форм кислорода (АФК) превышает естественную антиоксидантную защиту организма, что приводит к повреждению клеток.

Существует три различные формы активных форм кислорода: первичная форма АФК, включающая супероксидный анион, из которого вторичные АФК могут быть получены напрямую или косвенно, вторичная форма АФК, включающая перекись водорода, гидроксильный радикал и пероксильный радикал, и третичная форма АФК, представленная азотистыми соединениями (пероксиазотистая кислота, нитроксильный анион, пероксинитрил и закись азота) [2]. Эякулят человека состоит из различных типов клеток, таких как зрелые и незрелые сперматозоиды, круглые клетки на разных стадиях сперматогенеза, лейкоциты и эпителиальные клетки. Двумя основными источниками активных форм кислорода в семенной жидкости являются лейкоциты и сами сперматозоиды. Однако предполагается, что лейкоциты вносят наибольший вклад в оксидативный стресс, поскольку по сравнению со сперматозоидами скорость образования активных форм кислорода в лейкоцитах в 1000 раз выше. Они считаются «внешним источником» АФК, в отличие от «внутреннего источника» — сперматозоидов, и сильно коррелируют с различными параметрами спермы, такими как фрагментация ДНК [3-5].

Кроме того, оксидативный стресс в семенной жидкости может быть следствием множества других экзогенных факторов, таких как загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами и факторы образа жизни, такие как ожирение, курение и злоупотребление алкоголем, а также наличие некоторых заболеваний, таких как варикоцеле, повреждение спинного мозга и инфекции мочеполовых путей [4]. Также описывается значительное увеличение продукции активных форм кислорода в семенной жидкости у мужчин старше 40 лет [6]. Однако, несмотря на более высокий уровень активных форм кислорода в семенной жидкости у мужчин старшего возраста, увеличения концентрации лейкоцитов в семенной жидкости обнаружено не было.

Низкие и контролируемые концентрации активных форм кислорода (АФК) играют важную роль в физиологических процессах сперматозоидов, таких как капацитация, гиперактивация, акросомные реакции и сигнальные процессы, необходимые для оплодотворения. Однако, повышение уровня активных форм кислорода значительно ухудшает функцию сперматозоидов; эти нарушения приводят к мужскому бесплодию [7].

Действительно, активные формы кислорода могут повреждать мембрану сперматозоидов, что приводит к снижению подвижности и нарушению слияния сперматозоидов с ооцитами [8]. Как было описано ранее, оксидативный стресс также может быть связан с повреждением ДНК сперматозоидов, что может привести к плохому развитию эмбриона, выкидышу или бесплодию [9]. Активные формы кислорода атакуют целостность ДНК в ядре сперматозоида, что приводит к модификации оснований, разрывам цепей и образованию поперечных сшивок хроматина. Хроматин сперматозоидов имеет высоко конденсированную и организованную структуру, которая защищает его от окислительного повреждения, делая его очень устойчивым к повреждению ДНК [10]. Однако, при слабой компактизации и неполном протаминировании хроматина, ДНК сперматозоидов более уязвима к оксидативному стрессу.

Во многих исследованиях отмечается центральная роль оксидативного стресса сперматозоидов в этиологии повреждения ДНК [7,11–13]. Эти результаты расширили более ранние наблюдения о роли окислительного стресса в этиологии мужского бесплодия [14,15]. Высокие концентрации активных форм кислорода у бесплодных мужчин были связаны с фрагментацией ДНК и плохой упаковкой хроматина.

Некоторые исследования показали, что прием антиоксидантов может улучшить целостность ДНК сперматозоидов и повлиять на наступление беременности [18]; поэтому существует явная необходимость в том, чтобы андрологические лаборатории имели возможность определять оксидативный стресс в сперме.

Рутинный анализ спермы позволяет врачам предположить наличие оксидативного стресса. У мужчин с оксидативным стрессом часто наблюдается снижение некоторых параметров семени, а также повышенная вязкость семенной плазмы [19]. Наличие инфекции уреаплазма уреалитикум [20] связано с повышенной продукцией активных форм кислорода. Как уже было описано, наличие большого количества круглых клеток может указывать на оксидативный стресс, вызванный лейкоцитоспермией [21], помимо этого, наличие аномальных морфологических форм сперматозоидов, связанных с избыточной остаточной цитоплазмой и цитоплазматическими каплями [22].

Здоровые фертильные мужчины с нормальными параметрами семенной жидкости почти всегда имеют низкий уровень повреждений ДНК, в то время как бесплодные мужчины с аномальными параметрами семенной жидкости имеют более высокую долю повреждений ДНК сперматозоидов [21]. У мужчин с идиопатическим бесплодием могут наблюдаться нормальные показатели семенной жидкости при нарушении целостности ДНК [24].

Целью нашего исследования была оценка любой возможной связи между дисбалансом окислительного стресса в сперме человека, оцененным с помощью OxiSperm, с наличием повышенной фрагментации ДНК сперматозоидов, оцененной с помощью анализа структуры хроматина сперматозоидов (SCSA), и высокой концентрацией круглых клеток.

Материалы и методы

В выборку исследования вошли 56 случайно выбранных мужчин из пар, страдающих мужским бесплодием в период с октября 2013 года по февраль 2014 года. Мужской фактор бесплодия определяется как неспособность пары зачать ребенка после одного года незащищенного полового акта с женщиной, которая имеет нормальный репродуктивный анамнез, нормальную овуляцию и проходимость маточных труб. Пациенты с мужским фактором бесплодия, включенные в исследование, были представлены мужчинами с нормальными параметрами спермы согласно критериям ВОЗ [25] и мужчины, у которых был хотя бы один дефект в количестве, подвижности или морфологии. Образцы с тяжелой диспермией (концентрация спермы менее 2×10 ⁶/мл) не были включены; для надежного выполнения различных анализов спермы требуется достаточное количество спермы.

Сбор и анализ спермы

Образцы спермы были получены путем мастурбации после 2–7 дней полового воздержания. После разжижения при температуре 37°C, стандартный комплексный анализ спермы для оценки макроскопических и микроскопических параметров проводился в соответствии с рекомендациями ВОЗ 2010 г. [25]. Особое внимание уделялось оценке и анализу круглых клеток.

Для SCSA и OxiSperm требуется крайне малая доля общего эякулята с достаточным количеством сперматозоидов. Для оценки окислительного стресса с помощью набора OxiSperm (Halotech DNA, Мадрид, Испания, ЕС) использовалась аликвота спермы. Для SCSA другая аликвота спермы разводилась в изотоническом фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) для доведения концентрации сперматозоидов до 2×10⁶/мл и замороживалась в жидком азоте; криопротекторы не использовались. Образцы с концентрацией сперматозоидов менее 5×10⁶/мл разбавляли в пропорции 1:1 сперма — PBS.

Иследование окидативного стресса с помощью OxiSperm

Уровни оксидативного стресса от N1 (низкий) до N4 (высокий) оценивались с помощью набора OxiSperm, измеряющего избыток супероксид-анионов в эякуляте. Тест основан на анализе с нитросиним тетразолием (NBT-тест) – хорошо зарекомендовавшем себя лабораторном методе, используемом для количественной оценки функции нейтрофилов и клеточного окислительного метаболизма [26]. NBT-тест оказался полезным для количественной оценки как лейкоцитов, так и [27] и активных форм кислорода [28]. В наборе OxiSperm нитросиний тетразолий находится в форме реактивного геля (РГ); водорастворимая соль тетразолия, инкубированная с клетками, под действием супероксид-анионов превращается в нерастворимый синий кристалл, известный как формазан. Эти кристаллы удерживаются внутри клетки, но могут быть высвобождены путем солюбилизации в растворе растворителя; они вызывают и усиливают интенсивность окраски в РГ от желтого до различных уровней фиолетово-синего, которую можно легко и сравнительно количественно оценить визуально с помощью цветовой шкалы. Интенсивность окраски связана с уровнем оксидативного стресса в образце (Рисунок 1).

Реактивный гель был разжижен в водяной бане при температуре 90°С в течение 5 минут, а затем приведен к температуре 37∘C. Реактивный гель смешивали с образцом спермы в пробирке Эппендорфа, чтобы получить конечную концентрацию сперматозоидов 1×10⁶/мл (объемная пропорция 1 : 1 сперма-РГ); можно умножать объемы на общий коэффициент до максимума в 100 мкл для обеих частей смеси. Смешивание образца производилось при температуре, близкой к 37°C∘, иначе гель загустеет. Застывание смеси происходило при температуре 4°C в течение 5 минут, а затем инкубация в течение 45 минут при 37∘C. Полученный цвет смеси сравнивали с цветовой схемой и оценивали соответствующий уровень оксидативного стресса. В качестве альтернативы можно использовать колориметр для измерения поглощения в диапазоне длин волн от 530 до 630 нм.

Для получения наилучших результатов тест проводился на свежих образцах спермы сразу после разжижения. Образцы тестировались не позднее, чем через 60 минут после эякуляции; при более длительной задержке возможны ложноположительные результаты. Также очень важно точно подсчитывать концентрацию сперматозоидов. Высокая концентрация сперматозоидов может привести к высокой интенсивности окраски из-за нарастания оксидативного стресса в результате столкновении сперматозоидов с последующим повреждением мембраны.

Образцы были впоследствии разделены на две группы в зависимости только от уровня оксидативного стресса, обнаруженного с помощью OxiSperm: образцы с низким уровнем ОС (LOS), включая уровни N1 и N2, и образцы с высоким уровнем ОС (HOS), включая уровни N3 и N4. Образцы LOS имеют оптимальный/низкий уровень АФК, который считается неспособным повредить клетки. Образцы HOS имеют настолько высокий уровень АФК, что могут вызывать патологические эффекты в сперматозоидах, такие как фрагментация ДНК.

Оценка фрагментации ДНК сперматазоидов методом SCSA

Повреждение ДНК сперматозоидов оценивалось методом SCSA, как описано ранее. Это проточный цитометрический тест, измеряющий способность ДНК сперматозоидов сохранять свою нативную двухцепочечную форму после воздействия кислой среды с последующим окрашиванием метахроматическим флуоресцентным красителем акридиновым оранжевым (6 мг/мл, Sigma, Сент-Луис, штат Миссури, США) для дифференциации одноцепочечных и двухцепочечных разрывов ДНК.

Сперматозоиды с поврежденной ДНК денатурируют легче, чем сперматозоиды с неповрежденной ДНК. Акридиновый оранжевый внедряется в нативную ДНК и флуоресцирует зеленым или флуоресцирует красным при связывании с одноцепочечной (аномальной) ДНК.

Процент сперматозоидов с денатурированной ДНК представляет собой Индекс фрагментации ДНК (DFI). Анализ измеряет зеленую и красную флуоресценцию, испускаемую каждым сперматозоидом.  SCSA проводилась в соответствии с протоколом, описанным Эвенсоном и др. [29] с некоторыми модификациями нашей лаборатории. Проточный цитометр Бекман Коултер FC 500 (Beckman Coulter, Пасадена, Калифорния, США) был установлен с фильтрами 488 нм и цветовыми фильтрами для сбора красной (≥630 нм) и зеленой (от 515 до 530 нм) флуоресценции.

Замороженные образцы быстро размораживались при температуре 37°C на водяной бане, пока последний остаток льда не исчезнет и 100мл образца обрабатывали 200мл раствора кислоты (0,08 N HCl, 0,15 M NaCl и 0,1% Triton-X 100, pH 1,2) в течение 30 секунд, чтобы вызвать денатурацию ДНК сперматозоидов. 600мл окрашивающего раствора акридинового оранжевого (1,2 мл, 6YК суспензии сперматозоидов добавляли 100 г/мл и инкубировали в течение 3 минут.) Окрашенный образец помещали в проточный цитометр и немедленно запускали поток образца.

В каждом образце анализировалось 10 000–20 000 клеток. Для проведения статистических исследований были проведены повторные измерения с отбором проб из той же размороженной

аликвоты. Процент сперматозоидов с денатурированной ДНК был выражен в единицах DFI с использованием FCS4 — программное обеспечение, которое создает диаграмму рассеяния, показывающую соотношение зеленых (не фрагментированных) и красных (фрагментированных) сперматозоидов (Рисунок 2). Статистический порог установлен на уровне <30% и ≥30% DFI для

нормальной и высокой фрагментации ДНК сперматозоидов соответственно.

Статистический анализ. Данные были представлены в виде медианных значений (межквартильных размахов), поскольку параметры спермы не были распределены нормально. Для проверки связи между уровнем оксидативного стресса и повреждением ДНК сперматозоидов (% DFI), а также между уровнем оксидативного стресса и параметрами спермы, включая концентрацию круглых клеток, использовался двухвыборочный критерий суммы рангов Уилкоксона (критерий Манна-Уитни). Значение <0,05 считалось статистически значимым.

Также был проведен линейный регрессионный анализ для изучения изменения индекса фрагментации ДНК в соответствии с повышением уровня оксидативного стресса.

Результаты

Таблица 1 демонстрирует связь параметров спермы и уровня оксидативного стресса, полученных в ходе исследования.

Таблица 1:

Сводная статистика показателей спермы и уровня оксидативного стресса

Статистически значимых различий не обнаружено (<0,05) при сравнении значений, полученных для каждой из переменных традиционного анализа спермы между двумя группами. Параметры эякулята, оцениваемые при анализе спермы, включали концентрацию сперматозоидов (= 0,2297), подвижность сперматозоидов (= 0,9462), жизнеспособность сперматозоидов (= 0,7312) и процент нормальных форм сперматозоидов (= 0,5513).

Медиана индекса фрагментации ДНК (DFI) и концентрации круглых клеток в двух группах, в зависимости от уровня оксидативного стресса, представлена в Таблице 2.

Таблица 2:

Сводная статистика индекса фрагментации ДНК и концентрации круглых клеток

по группам уровня оксидативного стресса

Данные представлены в виде медиан. Для статистического анализа использовался двухвыборочный критерий суммы рангов Уилкоксона (критерий Манна-Уитни).  Полученный показатель представляет собой статистическое сравнение между медианой группы LOS и HOS.

Что касается оценки целостности ДНК сперматозоидов, мы выявили более высокий и статистически более значимый DFI ≥30% в группе HOS по сравнению с группой LOS (= 0,0379)

предполагая, что дисбаланс супероксид-анионов связан с фрагментацией ДНК сперматозоидов. Группа HOS показывает медиану DFI 21,58% (6,84–64,44), тогда как группа LOS имеет медиану DFI 16,345% (4,99–45,07). Линейный регрессионный анализ показывает статистически значимую связь между DFI и уровнем общей выживаемости с коэффициентом корреляции 3,76 (95% 0,52–6,99).

Оценивая концентрацию круглых клеток в образцах спермы, мы наблюдали высокие уровни оксидативного стресса при высокой концентрации этого типа клеток, что предполагает сильную корреляцию между концентрацией круглых клеток >1,5 × 10⁶/мл в сперме и высокие уровни ОС (= 0,0084). Это подтверждает данные о том, что активные формы кислорода в эякуляте человека в основном продуцируются лейкоцитами. Средняя концентрация круглых клеток в группе HOS составляет 0,8×10⁶/мл (0,1–3,3) против 0,3 ×10⁶/мл (0,1–2,5) в группе LOS.

Обсуждение

Оксидативный стресс считается одной из основных причин мужского бесплодия, вызывая нарушение функции сперматозоидов. Оксидативный стресс сперматозоидов – это состояние, связанное с повреждением клеток, вызванного кислородом и свободными радикалами, полученными из кислорода, известными как активные формы кислорода [30]. Как правило, большинство врачей не тестируют бесплодных мужчин на наличие оксидативного стресса, поскольку доступные тесты дорогостоящи или сложны в проведении по сравнению с обычным анализом спермы.

Поскольку прием антиоксидантов может улучшить целостность ДНК сперматозоидов и исход беременности, существует клиническая необходимость в проведении анализов для определения оксидативного стресса, чтобы сопоставить эти результаты с фрагментацией ДНК сперматозоидов. 31]. По какой-то причине ни один из рекомендованных ВОЗ параметров (концентрация сперматозоидов, подвижность и морфология) недостаточен для определения мужского бесплодия. Несмотря на то, что стандартный анализ спермы по-прежнему остаётся основой клинической оценки мужского бесплодия, параметры ВОЗ учитывают лишь некоторые

аспекты качества и функции спермы, что может объяснить, почему их дискриминационная способность в отношении фертильности довольно низкая, а также почему наблюдается высокая частота идиопатического бесплодия.32,33].

Насколько нам известно, это исследование впервые сопоставляет оксидативный стресс с помощью теста OxiSperm с маркерами качества спермы, такими как фрагментация ДНК сперматозоидов, оцениваемая с помощью SCSA. Выявлена значимая положительная корреляция (<0,05). Была отмечена связь между высоким уровнем оксидативного стресса в семенной жидкости, зависящим от дисбаланса супероксид-анионов, и увеличением фрагментации ДНК сперматозоидов, в соответствии с хорошо известной способностью активных форм кислорода (ROS) повреждать ДНК сперматозоидов [34].

Некоторые авторы сообщают о положительной корреляции между продукцией активных форм кислорода (ROS) и фрагментацией ДНК сперматозоидов [4,35]. Положительная корреляция (<0,05). Также было отмечено, что при концентрации круглых клеток в семенной жидкости 1 500 000/мл и росте фрагментации ДНК сперматозоидов; это связано с тем, что круглые клетки в семенной жидкости включают лейкоциты [36] и мужские половые клетки, которые считаются основными эндогенными источниками АФК.

Однако связь высоких уровней оксидативного стресса и снижения нормальных показателей спермы не достигла статистической значимости (>0,05), и не демонстрирует предыдущие выводы о том, что сперматозоиды пациентов с аномальной концентрацией, морфологией и подвижностью сперматозоидов проявляют повышенный уровень повреждений ДНК [13]. Вероятно, это связано с тем, что у всех пациентов, участвовавших в исследовании, имелись андрологические показания для оценки фрагментации ДНК сперматозоидов. В эту группу пациентов включены мужчины с идиопатическим бесплодием, которое диагностируется в тех случаях, когда рутинные методы исследования, включая анализ спермы, не позволяют определить причину отсутствия беременности. Другие методы исследования, такие как оценка уровня активных форм кислорода (ROS) и фрагментации ДНК, могут выявить истинную причину бесплодия в этих случаях [37].

По этим причинам точная оценка уровня оксидативного стресса в семенной жидкости должна стать неотъемлемой частью андрологического обследования, чтобы помочь врачам определить состояние фертильности и подобрать оптимальное лечение. Данное исследование подтверждает эффективность OxiSperm как недорогого и простого в выполнении метода оценки окислительного стресса сперматозоидов. Мы признаем, что наше исследование относительно небольшое и требует воспроизведения другими специалистами и сравнения с другими методами оценки повреждения ДНК сперматозоидов, такими как COMET- и TUNEL-анализы.

Целью на будущее станет сбор большего количества данных для оценки того, играет ли семенная плазма ведущую роль в процессе окислительного стресса, как это следует из полученных результатов.

Заключение

В заключение следует отметить, что оксидативный стресс связан с фрагментацией ДНК сперматозоидов и высокой концентрацией круглых клеток. Оценка оксидативного стресса сперматозоидов и повреждений ДНК внесет значительный вклад в стандартный профиль анализа спермы и станет диагностическим инструментом для оценки мужского бесплодия, особенно идиопатического происхождения, что необходимо учитывать при андрологическом обследовании.

(перевод исследовательской статьи)

Источник: Valeria Maria Iommiello, Elena Albani, Alessandra Di Rosa, Alessandra Marras, Francesca Menduni, Giovanna Morreale, Shanti Lia Levi, Benedetta Pisano, and Paolo Emanuele Levi-Setti/ Ejaculate Oxidative Stress Is Related with Sperm DNA Fragmentation and Round Cells //International Journal of Endocrinology Volume 2015, Article ID 321901, 6 pages

http://dx.doi.org/10.1155/2015/321901

Ссылки

[1] Р. Дж. Эйткен и Г. Н. де Юлиис, «О возможных причинах повреждения ДНК в сперматозоидах человека», Молекулярная репродукция человека, т. 16, № 1, Идентификатор статьи gap059, стр. 3–13, 2009.

[2] К. Хванг и Дж. Д. Лэмб, «Молекулярные механизмы мужского бесплодия», в Мужское бесплодие, С. Дж. Парекаттил и А.Агарвал, ред., Спрингер, Нью-Йорк, США, 2012 г.

[3] Р. Хенкель, Э. Кирспель, Т. Штальф и др., «Влияние активных форм кислорода, продуцируемых сперматозоидами и лейкоцитами, на функции спермы у пациентов без лейкоцитоспермии», Фертильность и бесплодие, т. 83, № 3, стр. 635–642, 2005.

[4] М. Кокуцца, С.К. Сикка, К.С. Атайде и А. Агарвал, «Клиническая значимость окислительного стресса и повреждения хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии: анализ, основанный на доказательствах», Международный бразильский журнал урологии, т. 33, № 5, стр. 603–621, 2007.

[5] Г. Актан, С. Догру-Аббасоглу, К. Кючукгергин, А. Кадыоглу, Г. Оздемирлер-Эрата и Н. Кочак-Токер, «Тайна идиопатического мужского бесплодия: является ли окислительный стресс реальным риском?» Фертильность и бесплодие, т. 99, № 5, стр. 1211–1215, 2013.

[6] М. Кокуцца, К.С. Атайде, А. Агарвал и др., «Возрастное увеличение количества активных форм кислорода в чистой сперме у здоровых фертильных мужчин», Урология, т. 71, № 3, стр. 490–494, 2008.

[7] Р.А. Салех и А. Агарвал, «Окислительный стресс и мужское бесплодие: от исследовательского стенда к клинической практике», Журнал андрологии, т. 23, № 6, стр. 737–752, 2002.

[8] Р. Дж. Эйткен, «Роль свободных кислородных радикалов и функция сперматозоидов», Международный журнал андрологии, т. 12, № 2, стр. 95–97, 1989.

[9] Б. Озмен, Н. Кутлаки, М. Юссри, К. Дидрих и С. Аль-Хасани, «Повреждение ДНК сперматозоидов человека при вспомогательной репродукции: происхождение, диагностика, последствия и безопасность», Репродуктивная биомедицина онлайн, т. 14, № 3, ст. 2730, стр. 384–395, 2007.

[10] Р. Т. Шульте, Д. А. Оль, М. Сигман и Г. Д. Смит, «Повреждение ДНК сперматозоидов при мужском бесплодии: этиология, анализы и результаты», Журнал вспомогательной репродукции и генетики, т. 27, № 1, стр. 3–12, 2010.

[11] Р. Дж. Эйткен, М. А. Бейкер и Д. Сойер, «Окислительный стресс в мужской зародышевой линии и его роль в этиологии мужского бесплодия и генетических заболеваний», Репродуктивная биомедицина онлайн, т. 7, №1, стр. 65–70, 2003.

[12] М. Мустафа, Р.К. Шарма, Дж. Торнтон и др., «Связь между продукцией ROS, апоптозом и денатурацией ДНК в сперматозоидах пациентов, обследованных на бесплодие», Репродукция человека, т. 19, № 1, стр. 129–138, 2004.

[13] Дж. Новотны, Н. Азиз, Р. Рыбар и др., «Связь между продукцией активных форм кислорода в сперме человека и повреждением ДНК сперматозоидов, оцененным с помощью анализа структуры хроматина сперматозоидов», Биомедицинские статьи, т. 157, № 4, стр. 383–386, 2013.

[14] Р. Джонс, Т. Манн и Р. Шеринс, «Перекисное расщепление фосфолипидов в сперматозоидах человека, спермицидные свойства перекисей жирных кислот и защитное действие семенной плазмы», Фертильность и бесплодие, т. 31, № 5, стр. 531–537, 1979.

[15] Р. Дж. Эйткен и Дж. С. Кларксон, «Клеточная основа дефектной функции сперматозоидов и ее связь с генезисом активных форм кислорода человеческими сперматозоидами», Журнал репродукции и фертильности, т. 81, № 2, стр. 459–469, 1987.

[16] Э. Греко, М. Якобелли, Л. Риенци, Ф. Убальди, С. Ферреро и Дж. Тесарик, «Снижение частоты фрагментации ДНК сперматозоидов с помощью перорального лечения антиоксидантами», Журнал  андрологии, т. 26, № 3, стр. 349–353, 2005.

[17] YJR Ménézo, A. Hazout, G. Panteix и др., «Антиоксиданты для снижения фрагментации ДНК сперматозоидов: неожиданный побочный эффект», Репродуктивная биомедицина онлайн, т. 14, № 4, статья 2669, стр. 418–421, 2007.

[18] Э. Греко, С. Романо, М. Якобелли и др., «ИКСИ в случаях повреждения ДНК сперматозоидов: благоприятный эффект пероральной антиоксидантной терапии», Репродукция человека, т. 20, № 9, стр. 2590–2594, 2005.

[19] Б. Айдемир, И. Онаран, А. Р. Кизилер, Б. Алиджи и М. К. Акйолджу, «Влияние окислительного повреждения на вязкость семенной жидкости у бесплодных мужчин», Журнал андрологии, т. 29, № 1, стр. 41–46, 2008.

[20] Y. Wang, C.-L. Liang, J.-Q. Wu, C. Xu, S.-X. Qin и E.-S. Gao, «Влияют ли инфекции половых путей на качество спермы?» Азиатский журнал андрологии, т. 8, № 5, стр. 562–568, 2006.

[21] Р. Дж. Эйткен и М. А. Бейкер, «Окислительный стресс, сперматозоиды и лейкоцитарная инфильтрация: отношения, созданные противоборствующими силами микробного вторжения и поиска совершенства», Журнал репродуктивной иммунологии, т. 100, № 1, стр. 11–19, 2013.

[22] Р. Менквельд, «Клиническое значение низкого нормального значения морфологии сперматозоидов, предложенного в пятом издании Руководства ВОЗ по лабораторному исследованию и обработке человеческой спермы», Азиатский журнал андрологии, т. 12, № 1, стр. 47–58, 2010.

[23] А. Зини, Р. Белецки, Д. Фан и М.Т. Зенцес, «Корреляции между двумя маркерами целостности ДНК сперматозоидов, денатурацией ДНК и фрагментацией ДНК у фертильных и бесплодных мужчин», Фертильность и бесплодие, т. 75, № 4, стр. 674–677, 2001.

[24] Б.Дж.М. Майорга-Торрес, В. Кардона-Майя, А. Кадавид и М. Камарго, «Оценка функциональных параметров сперматозоидов у нормозооспермических бесплодных лиц», Actas Urologicas Espanolas, т. 37, № 4, стр. 221–227, 2013.

[25] Всемирная организация здравоохранения, Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию и обработке человеческой спермы, Издательство ВОЗ, Женева, Швейцария, 5-е издание, 2010 г.

[26] Р. Л. Бэнер, Л. А. Боксер и Дж. Дэвис, «Биохимическая основа восстановления нитросинего тетразолия в нормальных человеческих и хронических гранулематозных полиморфноядерных лейкоцитах», Кровь, т. 48, № 2, стр. 309–313, 1976.

[27] HS Choi, JW Kim, YN Cha и C. Kim, «Количественный анализ нитросинего тетразолия для определения внутриклеточной продукции супероксид-аниона в фагоцитарных клетках», Журнал

иммуноанализа и иммунохимии, т. 27, № 1, стр. 31–44, 2006.

[28] Н. Эсфандиари, Р.К. Шарма, Р.А. Салех, А. Дж. Томас-младший и А. Агарвал, «Применимость теста восстановления нитросинего тетразолия для оценки продукции активных форм кислорода

семенными лейкоцитами и сперматозоидами», Журнал андрологии, т. 24, № 6, стр. 862–870, 2003.

[29] Д. П. Эвенсон, К. Л. Ларсон и Л. К. Йост, «Анализ структуры хроматина сперматозоидов: его клиническое применение для обнаружения фрагментации ДНК сперматозоидов при мужском бесплодии и сравнение с другими методами», Журнал андрологии, т. 23, № 1, стр. 25–43, 2001.

[30] А. Агарвал, Г. Вирк, К. Онг и С.С. Дю Плесси, «Влияние окислительного стресса на мужскую репродуктивность», Всемирный журнал мужского здоровья, т. 32, № 1, стр. 1–17, 2014.

[31] О. Тунц, Дж. Томпсон и К. Тремеллен, «Разработка анализа НСТ как маркера окислительного стресса сперматозоидов», Международный журнал андрологии, т. 33, № 1, стр. 13–21, 2010.

[32] Д.С. Гузик, Дж.В. Оверстрит, П. Фактор-Литвак и др., «Морфология, подвижность и концентрация сперматозоидов у фертильных и бесплодных мужчин», Медицинский журнал Новой Англии, т. 345, № 19, стр. 1388–1393, 2001.

[33] Дж. П. Э. Бонде, Э. Эрнст, Т. К. Йенсен и др., «Связь между качеством спермы и фертильностью: популяционное исследование 430 женщин, планирующих первую беременность», Ланцет, т. 352, № 9135, стр. 1172–1177, 1998.

[34] Р. Дж. Эйткен, Э. Гордон, Д. Харкисс и др., «Относительное влияние окислительного стресса на функциональную компетентность и геномную целостность человеческих сперматозоидов», Биология размножения, т. 59, № 5, стр. 1037–1046, 1998.

[35] Р. Дж. Эйткен и К. Крауз, «Окислительный стресс, повреждение ДНК и Y-хромосома», Репродукция, т. 122, № 4, стр. 497–506, 2001.

[36] RK Sharma, FF Pasqualotto, DR Nelson, J. Thomas AJ и A. Agarwal, «Связь между количеством семенных лейкоцитов и окислительным стрессом у мужчин, проходящих лечение в клинике по лечению бесплодия», Журнал андрологии, т. 22, № 4, стр. 575–583, 2001.

[37] Ф.Ф. Паскуалотто, Р.К. Шарма, Х. Кобаяши, Д.Р. Нельсон, А. Томас-младший и А. Агарвал, «Окислительный стресс у нормоспермических мужчин, проходящих обследование на бесплодие», Журнал андрологии, т. 73, стр. 459–464, 2001.