Обзор современных культуральных сред для ЭКО

ОБЗОР СОВРЕМЕННЫХ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ЭКО

Бесплодие по‑прежнему представляет серьёзную медико‑социальную проблему: распространённость этого нарушения достигает 12–18 % в популяции как женщин, так и мужчин. Ухудшение способности к зачатию обычно вызвано сочетанием негативных факторов. Среди ключевых причин можно выделить:

• нездоровый образ жизни;

• вредные привычки (курение, употребление алкоголя и т. д.);

• неблагоприятные условия труда;

• негативное влияние окружающей среды;

• частые воспалительные процессы в органах малого таза;

• увеличение количества возрастных пациентов;

• различные заболевания репродуктивной системы.

   Для максимально быстрого наступления беременности важно провести объективную оценку репродуктивной функции супружеской пары и установить причину бесплодия, а затем реализовать рациональные подходы к лечению, включая применение вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

  ВРТ – комплекс методов, при котором отдельные или все этапы зачатия и/или раннего развития эмбриона до его переноса в полость матки осуществляются в лабораторных условиях.

Цикл ВРТ: основные этапы

Обследование и подготовка пациентов

Перед началом программы ВРТ супружеская пара проходит всестороннее медицинское обследование. По итогам диагностики врач выявляет причину бесплодия и подбирает наиболее подходящий протокол вспомогательных репродуктивных технологий.

Получение и подготовка спермы

Для проведения процедур ВРТ можно использовать сперму либо супруга, либо донора.

• Сперма супруга может применяться в двух форматах:

  • в свежем виде — мужчина сдаёт эякулят непосредственно в день пункции фолликулов у партнёрши;

  • в замороженном виде — биоматериал сдаётся заблаговременно и сохраняется методом криоконсервации.

• Сперма донора. Используется исключительно после заморозки — это связано с обязательным карантинным сроком в 6 месяцев. Такой период нужен, чтобы провести повторные анализы донора и убедиться в отсутствии инфекционных заболеваний.

   Если у мужчины диагностированы азооспермия, аспермия или ретроградная эякуляция либо в эякуляте отсутствуют жизнеспособные сперматозоиды, клетки извлекают с помощью специальных процедур: ПЕСА, ТЕСА, МЕСА или ТЕСЕ.

  После того как эякулят получен, специалисты проводят его детальный анализ — оценивают ключевые показатели качества спермы. На основании результатов исследования врач подбирает наиболее подходящий метод оплодотворения.

Обработка биоматериала

Сперматозоиды отделяют от прочих компонентов эякулята: семенной плазмы, лейкоцитов, мёртвых и малоподвижных клеток, дебриса. Цель этой процедуры — выделить фракцию наиболее активных и жизнеспособных сперматозоидов, которые в дальнейшем будут использованы в рамках программ ВРТ. К классическим методам подготовки спермы относятся:

• Центрифугирование в градиенте плотности (Sil‑Select Stock, Sil‑Select Plus). При центрифугировании компоненты эякулята разделяются по плотности — тяжёлые элементы (лейкоциты, дебрис, мёртвые клетки) задерживаются вверху, а подвижные морфологически нормальные сперматозоиды оседают на дне пробирки. Получают концентрированную фракцию жизнеспособных клеток для ВРТ.

• Метод флотации («swim‑up») (FertiCult Flushing). Обработанный эякулят помещают в культуральную среду, где наиболее подвижные и функционально полноценные сперматозоиды самостоятельно поднимаются в верхний слой. Через некоторое время эту фракцию отбирают — она содержит клетки с высоким потенциалом оплодотворения. Метод имитирует прохождение сперматозоидов через цервикальную слизь и не предполагает агрессивного воздействия на клетки.

     Стимуляция суперовуляции и получение ооцитов

  В естественном цикле у женщины созревает и овулирует лишь один фолликул. Чтобы увеличить шансы на успешное зачатие в рамках ВРТ, проводят гормональную стимуляцию — она вызывает одновременное развитие сразу нескольких фолликулов.

   Извлечение ооцитов выполняют посредством трансвагинальной пункции под контролем УЗИ. Для аспирации содержимого фолликулов применяют либо специальную вакуумную помпу, либо стерильные шприцы. Если стандартные условия для пункции не подходят — например, из‑за необычного расположения яичников или обширного спаечного процесса — прибегают к лапароскопическому методу получения ооцитов. Процедура пункции спланирована так, чтобы эмбриолог мог сразу осмотреть содержимое каждого фолликула после его извлечения. Если при первичном анализе фолликулярной жидкости ооцит не обнаружен, врач выполняет промывание фолликула. Для этой манипуляции применяют специальные буферные растворы либо готовые среды для аспирации (FertiCult Aspiration medium).

    Денудация ооцитов

  Не все ооциты, полученные при аспирации фолликулов, готовы к оплодотворению — их предварительно классифицируют по степени зрелости. Для этого удаляют окружающие клетки кумулюса и corona radiata (денудация).

   Процесс требует высокой осторожности и опыта эмбриолога, поскольку сочетает механическое и ферментативное воздействие. После денудации оценивают зрелость ооцита: в идеале должна наблюдаться экструзия первого полярного тельца (указывает на вторую метафазу), а также выявляют морфологические дефекты (внутриклеточную грануляцию, фрагментацию полярного тельца, увеличенное перивителлиновое пространство) для отбора наиболее жизнеспособных клеток.

  Для денудации используют гиалуронидазу — фермент, расщепляющий гиалуроновую кислоту между клетками кумулюса; стандартная концентрация в лабораториях — 80 IU/mL (80 IU Hyaluronidase in Flushing).

    Оплодотворение in vitro

    Существуют два основных метода:

• Классическое ЭКО: оплодотворение происходит приближённо к естественным условиям, сперматозоид самостоятельно преодолевает слой клеток кумулюса, распознаёт и связывается с рецепторами блестящей оболочки ооцита, после чего проникает внутрь — сливается с плазматической мембраной ооцита.

• ИКСИ: специально подготовленный иммобилизированный сперматозоид (10 % PVP in Flushing Medium) с помощью микроманипуляционного оборудования вводят непосредственно в цитоплазму ооцита. При этом поддержание оптимальных условий для клеток (стабильных показателей температуры, pH, осмоляльности и т. д.) обеспечивают специализированные культуральные среды (FertiCult Flushing).

     Культивирование эмбрионов

  Важнейшая задача эмбриологического этапа — обеспечить условия развития эмбрионов, максимально сходные с естественными (in vivo). Этого добиваются за счёт грамотного подбора культуральной среды (GAIN medium) и строгого контроля ключевых параметров — в первую очередь температуры и уровня pH, которые поддерживают на физиологически нормальном уровне.

   Перенос эмбриона в матку

  Завершающий этап цикла ВРТ — перенос эмбрионов в полость матки. Его результативность определяется комплексом факторов:

• качеством и числом эмбрионов, отобранных для переноса;

• точностью выполнения всех технологических процедур со стороны эмбриолога;

• мастерством врача при введении эмбриона — корректностью техники переноса;

• другими условиями, влияющими на вероятность успешной имплантации.

Для выполнения процедуры используют специальный катетер, через который эмбрион вместе с культуральной средой (GAIN medium) аккуратно доставляют в матку.

     Криоконсервация

  Разработка методов криоконсервации открыла новые возможности ВРТ. Сейчас можно замораживать:

• сперматозоиды (SpermFreeze);

• ооциты;

• эмбрионы.

Замороженный материал может быть использован в текущем цикле ВРТ либо в будущем, при наличии медицинских показаний и согласия пациента.

        Использование культурального масла

  На различных этапах ВРТ необходимо использование вспомогательной среды – культурального масла (FertiCult Mineral Oil), которое наносят поверх капель другой культуральной среды (в зависимости от этапа ВРТ) в чашках Петри, что в результате обеспечивает:

• стабилизацию температуры и pH среды;

• минимизацию испарения культуральной среды;

• защиту от перепадов температуры и колебаний уровня CO₂;

• создание условий, максимально приближённых к физиологическим;

• снижение риска контаминации (загрязнения) среды.

   Значение культуральных сред для ЭКО

  В основе всех этапов ВРТ лежит использование специализированных сред для ЭКО, которые обеспечивают необходимые условия для выживания и развития эмбрионов in vitro. Их основная задача — максимально имитировать естественную среду, чтобы создать оптимальные условия для роста эмбриона на всех стадиях его развития (от зиготы до бластоцисты).

Культуральные среды:

• поддерживают стабильный уровень pH и осмоляльности, предотвращая стресс и гибель клеток;

• снабжают эмбрион питательными веществами: аминокислотами (строительным материалом для белков), углеводами (глюкозой, пируватом, лактатом — источниками энергии), витаминами и микроэлементами (участниками метаболических процессов), факторами роста (стимулирующими развитие клеток) и белками (например, альбумином — он поддерживает осмотическое давление и защищает клетки);

• включают антибиотики для профилактики бактериального загрязнения и буферные системы (бикарбонаты или HEPES) для стабилизации кислотно‑щелочного баланса;

• защищают эмбрионы от внешних воздействий — инфекций и токсических факторов.

Качество и состав культуральной среды напрямую влияют на жизнеспособность эмбрионов, их морфологическое развитие, вероятность формирования бластоцисты и, в конечном счёте, на успех имплантации после переноса в матку и исход всей процедуры ЭКО.

Литературные источники:

1. Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание [WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, sixth edition]. Женева: Всемирная организация здравоохранения; 2023 r. Лицензия: CC BY-NC-SA 3.0 IGO.

2. Руководство по клинической эмбриологии / [Корсак В.С., Балахонов А.В., Бичевая Н.К. и др.] ; под ред. Корсака В.С. — 2-е изд. — М. : СИМК, 2019. — 224 с. — ISBN 978-5-91894-076-1.

3. Петрова Е. В., Михалевич С. И. Основные этапы преодоления бесплодия с использованием программы вспомогательных репродуктивных технологий и ее модификаций // Медицинские новости. 2012. №2. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/osnovnye-etapy-preodoleniya-besplodiya-s-ispolzovaniem-programmy-vspomogatelnyh-reproduktivnyh-tehnologiy-i-ee-modifikatsiy.

4. Moura BR, Gurgel MC, Machado SP, Marques PA, Rolim JR, Lima MC, Salgueiro LL. Low concentration of hyaluronidase for oocyte denudation can improve fertilization rates and embryo quality. JBRA Assist Reprod. 2017 Feb 1;21(1):27-30. doi: 10.5935/1518-0557.20170008. PMID: 28333029; PMCID: PMC5365197.